بررسی فعالیت ضد میکروبی نانوذرات نقره بیوسنتز شده با استفاده از عصاره آبی گیاه آقطی

Transcript

1 بررسی فعالیت ضد میکروبی نانوذرات نقره بیوسنتز شده با استفاده از عصاره آبی گیاه آقطی امید عزیزیان شرمه جعفر ولی زاده میثم نوروزی فر علی قاسمی 1( گروه شیمی دانشکده علوم پایه دانشگاه سیستان و بلوچستان زاهدان ایران 2( گروه زیست شناسی دانشکده علوم پایه دانشگاه سیستان و بلوچستان زاهدان ایران چکیده تاریخ دریافت: 95/2/5 واژه های کلیدی: فعالیت ضد میکروبی نانوذرات نقره گیاه آقطی بیوسنتز تاریخ پذیرش: 95/2/22 مقدمه: مطالعات گسترده ای در مورد پتانسیل استفاده از ترکیبات ضد میکروبی موجود در گیاهان و نیز استفاده از نانوذرات برای کنترل و درمان عوامل بیماری زا صورت گرفته است. هدف از مطالعه حاضر سنتز زیستی نانوذرات نقره با استفاده از عصاره آبی برگ گیاه آقطی و بررسی فعالیت ضد میکروبی آن ها می باشد. مواد و روش ها: برای سنتز نانوذرات نقره عصاره تازه تهیه و به محلول نیترات نقره با غلظت 1 میلی موالر اضافه شد. برای به دست آوردن نانوذراتی با شکل و اندازه مطلوب پارامترهای موثر بر سنتز نانوذرات نقره مانند ph حجم عصاره غلظت یون نقره دما و زمان واکنش بهینه شدند و مورد مطالعه قرار گرفتند. فعالیت ضد میکروبی عصاره و نانوذرات نقره به دو روش انتشار چاهکی و تعیین )PTTC اشرشیاکلی) 1399 )PTTC باسیلوس سرئوس) 1154 )PTTC علیه چهار باکتری استافیلوکوکوس اورئوس) 1112 MIC سودوموناس آئروژینوزا) 177 )PTTC و دو قارچ آسپرژیلوس نایجر) 512 )PTTC و کاندیدا آلبیکنس) 527 )PTTC مورد بررسی قرار گرفتند. یافته های پژوهشی: پس از افزودن عصاره به محلول نیترات نقره رنگ محلول به رنگ قهوه ای تغییر رنگ داد. نانوذرات نقره بیشترین جذب را در 45 نانومتر نشان دادند و دارای شکل کروی و میانگین اندازه آن ها بین 812 نانومتر بوده است. این نانوذرات فعالیت ضد میکروبی چشمگیری بر روی نمونه های مورد آزمایش نشان دادند به طوری که در غلظت های بسیار پایین از رشد باکتری ها و قارچ ها جلوگیری کردند بحث و نتیحه گیری: گیاهان به دلیل داشتن خاصیت آنتی اکسیدانی و ترکیبات ثانویه فراوان نقش احیاء کنندگی و پایدارسازی نانوذرات را ایفا می کنند. در این پژوهش نانوذرات نقره توسط عصاره آبی برگ گیاه آقطی سنتز شد. نانوذرات نقره سنتز شده فعالیت ضد میکروبی باالیی از خود نشان دادند. omidaziziyan@yahoo.com *نویسنده مسئول: گروه شیمی دانشکده علوم پایه دانشگاه سیستان و بلوچستان زاهدان ایران 29

2 مقدمه بررسی فعالیت ضد میکروبی نانوذرات نقره بیوسنتز شده... امید عزیزیان شرمه و همکاران با توجه به استفاده بی رویه از آنتی بیوتیک ها و افزایش مقاومت در باکتری ها یافتن جایگزین های مناسب برای آنتی بیوتیک ها امری ضروری می باشد. به همین دلیل مطالعات گسترده ای در مورد پتانسیل استفاده از ترکیبات ضد میکروبی موجود در گیاهان و نیز استفاده از نانوذرات برای کنترل و درمان عوامل بیماری زا صورت گرفته است) 1 (. فناوری نانو اصطالحا به طراحی بررسی خصوصیات تولید و استفاده از ساختارها و ابزارها با کنترل شکل و اندازه در مقیاس نانومتریک) 11 نانومتر( اطالق می شود) 2 (. به طور کلی روش های شیمیایی فیزیکی و زیستی را می توان روش های متداول تولید نانوذرات نام برد) 3 (. در سال های اخیر استفاده از روش های زیستی مانند استفاده از قارچ ها) 4 ( باکتری ها) 5 ( و عصاره گیاهان) 6 ( به دلیل ساده بودن کم هزینه بودن داشتن راندمان باال غیر سمی و سازگار با محیط زیست بودن توجه ویژه ای را نسبت به سایر روش ها به خود جلب کرده است) 7 (. در این بین گیاهان به علت فراوانی و عدم نیاز به شرایط و مواد غذایی خاص برای رشد گزینه ای مناسب برای سنتز سبز نانوذرات محسوب می شوند) 8 (. کامل بودن واکنش کم بودن زمان واکنش تولید نانوذرات با اشکال مختلف و یکنواخت بودن اندازه آن ها از دیگر مزایای استفاده از گیاهان برای سنتز نانوذرات محسوب می شود) 1 (. در میان نانو مواد و نانوذرات نانوذرات نقره به دلیل ویژگی وابسته به اندازشان توجه ویژه ای را به خود جلب کرده اند که از جمله آن ها می توان به خواص نوری شیمیایی الکتریکی کاتالیستی و ضد میکروبی اشاره نمود) (. نانوذرات نقره تولید شده با روش زیستی دارای ویژگی های مفیدی مانند میزان سطح باال اندازه کوچک و پراکندگی باال می باشند که مجموعه این عوامل سبب شده تا اثرات ضد میکروبی نانوذرات نقره در مقایسه با نقره افزایش چشمگیری داشته باشد) 13 (. با توجه به افزایش اثرات ضد میکروبی نقره در مقیاس نانو می توان از نانوذرات نقره برای مبارزه با عوامل بیماریزای مختلف استفاده نمود به طوری که امروزه با توسعه علم نانوتکنولوژی و تولید نانوذرات نقره این نانوذرات کاربردهای فراوانی در علوم مختلف مانند پزشکی داروسازی آرایشی و بهداشتی پیدا کرده اند) 14 ( و استفاده از نقره و نانوذرات آن به عنوان ماده باکتری کش قدرتمند رونق یافته است. البته اخیرا از نانوذرات نقره عالوه بر یک عامل ضد میکروبی در ردیابی DNA نیز استفاده شده است) (. خواص ضد میکروبی نانوذرات نقره و استفاده مفید از آن در بیوتکنولوژی و مهار اختصاصی میکروب ها در مطالعات مختلفی بررسی و به اثبات رسیده است به طوری که ناتوذرات نقره می توانند با مهار سیستم تنفسی باکتری ها بر متابولیسم و نیز فرآیندهای تولید مثل میکروارگانیسم ها اثرگذار باشند) 17 ( و باعث ایجاد آسیب هایی در غشای سلولی باکتری ها گردند) 18 (. مطالعات متعددی سنتز نانوذرات نقره با استفاده از گیاهان را به اثبات رسانیده اند. GardeaTorresdey و همکاران در سال 23 برای اولین بار تولید نانوذرات نقره توسط گیاهان را گزارش کرده اند) 1 (. هم چنین گیاهان Camellia Chenopodium album sinensis و Rhus coriaria توانستند یون های نقره را در اندازه های زیر 5 نانومتر احیاء کنند) 222 (. نانوذرات نقره سنتز شده از Garlic و Pinus eldarica با اندازه های به ترتیب 14 و 23 نانومتر خاصیت ضد میکروبی خوبی نسبت به برخی از باکتری ها از خود نشان دادند) (. اخیرا سنتز نانوذرات نقره از میوه بلوط و فعالیت ضد میکروبی نسبتا خوب آن علیه عفونت های های بیمارستانی گزارش شده است) 25 (. پژوهش حاضر به مطالعه پتانسیل باالی برگ گیاه آقطی در بیوسنتز نانوذرات نقره و تاثیر آن بر روی چند گونه باکتری و قارچ های بیماری زای انسانی می پردازد. مواد و روش ها مواد شیمیایی و میکروارگانیسم های مورد استفاده: تمامی مواد شیمیایی مورد استفاده با خلوص باال تهیه شدند. نمک نیترات نقره) )AgNO 3 هیدروکلریک اسید) HCl ( و سدیم هیدروکسید) NaOH ( از شرکت مرک) Germany )MERCK, و میکروارگانیسم های استفاده شده شامل باکتری های استافیلوکوکوس 29

3 اورئوس) 1112 )PTTC باسیلوس سرئوس) PTTC 1154( اشرشیاکلی) 1399 )PTTC سودوموناس آئروژینوزا) 177 )PTTC و قارچ های آسپرژیلوس نایجر) 512 )PTTC و کاندیدا آلبیکنس) PTTC 527( از سازمان پژوهش های علمی و صنعتی ایران )IROST( تهیه شدند. برای محلول سازی و شستشو از آب دوبار تقطیر استفاده شد. آماده سازی عصاره: گیاه آقطی با نام علمی.L Sambucus ebulus و نام محلی پ لم متعلق به خانواده کاپریفولیاسه و تیره پیچ امین الدوله از شهرستان بابلسر در استان مازندران جمع آوری شد)شکل شماره 1(. مقداری از برگ تازه آن پس از شستشو با آب دوبار تقطیر به دور از نور خورشید و در درجه حرارت اتاق خشک شد. سپس بخش های خشک شده توسط آسیاب برقی پودر گردید. جهت عصاره گیری برای سنتز نانوذرات نقره 1 گرم از پودر شکل شماره 1. برگ گیاه آقطی). L )Sambucus ebulus حاصل با 1 میلی لیتر از آب دوبار تقطیر به مدت 3 دقیقه و در دمای 4 درجه سانتی گراد در حمام آب گرم قرار گرفت. پس از خنک شدن توسط کاغذ صافی واتمن 42 صاف شد. برای حذف کامل ذرات معلق موجود در عصاره نمونه توسط سانتریفیوژ با سرعت 1 دور در دقیقه به مدت 1 دقیقه سانتریفیوژ شد. جهت بررسی فعالیت ضد میکروبی عصاره آبی گیاه 1 گرم از پودر گیاه با 1 میلی لیتر از آب دوبار تقطیر مخلوط و پس از 24 ساعت عمل فیلتراسیون مطابق مرحله قبل انجام گرفت. پس از تخلیص و حالل زدایی از عصاره آبی حاصل غلظت های و 1 میلی گرم بر میلی لیتر با حالل 5 درصد DMSO برای استفاده در آزمایش انتشار چاهکی و تعیین MIC تهیه گردید. محلول های حاصل در دمای 4 درجه سانتی گراد نگهداری شدند. سنتز اولیه نانوذرات نقره: جهت سنتز نانوذرات نقره 2 میلی لیتر از عصاره به 4 میلی لیتر از محلول 1 میلی موالر نیترات نقره در دمای آزمایشگاه اضافه شد. مشاهده شد که رنگ محلول به سمت قهوه ای تغییر رنگ داده است که این خود نشان دهنده تشکیل نانوذرات نقره می باشد. از محلول مورد نظر توسط دستگاه اسپکتروفتومتری فرابنفشمرئی) UVVis )spectroscopy, Jenway 6715 طیف گیری شد. بررسی پارامتر های موثر بر سنتز نانوذرات نقره تاثیر :ph جهت بررسی تاثیر ph و بهینه سازی آن 8 سری محلول حاوی 2 میلی لیتر عصاره و 4 میلی لیتر محلول نمک نیترات نقره با غلظت 1 میلی 29

4 بررسی فعالیت ضد میکروبی نانوذرات نقره بیوسنتز شده... امید عزیزیان شرمه و همکاران موالر ساخته و ph آن ها به ترتیب در) 4 6/ /5 7 و 8/5( تنظیم شد. از تمامی نمونه ها طیف اسپکتروفتومتری فرابنفشمرئی گرفته و در نهایت ph بهینه انتخاب شد. برای تنظیم ph از یکی از دو محلول سدیم هیدروکسید یا هیدروکلریک اسید با غلظت /1 موالر استفاده شد. تاثیر مقدار حجم عصاره: جهت بررسی تاثیر مقدار حجم عصاره مصرفی و بهینه سازی آن مقادیر 1 تا 5 میلی لیتر از عصاره به 4 میلی لیتر از نمک نیترات نقره با غلظت 1 میلی موالر افزوده و ph آن برابر ph بهینه تنظیم و از تمامی محلول های حاصل طیف اسپکتروفتومتری فرابنفشمرئی گرفته شد و در نهایت حجم بهینه انتخاب گردید. تاثیر غلظت نمک نقره نیترات: برای بررسی تاثیر غلظت یون نقره بر سنتز نانوذرات نقره و بهینه نمودن آن مقدار بهینه شده از حجم عصاره به 4 میلی لیتر از محلول نمک نیترات نقره با غلظت های) و 5( میلی موالر افزوده و ph واکنش برابر ph بهینه تنظیم شد. از تمامی محلول ها طیف اسپکتروفتومتری فرابنفشمرئی گرفته و غلظت بهینه انتخاب شد. تاثیر دما: جهت بررسی تاثیر افزایش دما بر سنتز نانوذرات نقره و بهینه نمودن آن محلول هایی با اعمال تمامی شرایط پیشین ساخته و به صورت جداگانه در دمای و 8 درجه سانتی گراد)در حمام آب گرم( قرار داده و طیف اسپکتروفتومتری فرابنفشمرئی تمامی آن ها گرفته شد و دمای بهینه انتخاب گردید. تاثیر زمان: جهت بررسی اثر زمان بر سنتز نانوذرات نقره و بهینه نمودن آن محلول حاصل از اعمال تمامی شرایط بهینه شده در زمان های مختلف)از لحظه مخلوط واکنشگرها تا 3 ساعت پس از آن( ساخته و از هر کدام به صورت مجزا طیف اسپکتروفتومتری فرابنفشمرئی گرفته و زمان بهینه انتخاب شد. مشخصه یابی نانوذرات نقره سنتز شده: برای تایید نتایج به دست آمده از طیف اسپکتروفتومتری فرابنفشمرئی اندازه و شکل نانوذرات سنتز شده توسط تکنیک های پراش پرتو ایکس) BrukerD8 و میکروسکوپ الکترونی عبوری) Zeiss )advance )EM1C مورد بررسی قرار گرفت. بررسی فعالیت ضد میکروبی: نمونه های میکروبی با استفاده از محیط کشت لوریا برتانی و سابورد دکستروز و بر اساس روش های استاندارد احیاء گردیدند و به منظور سوسپانسیون میکروبی از کشت 24 ساعته هر میکروارگانیسم به صورت مجزا به لوله های آزمایش حاوی 3 میلی لیتر مولر هینتون براث تلقیح شد و سوسپانسیونی با کدورت معادل نیم مک فارلند آماده گردید. بررسی اثرات ضد باکتریایی و ضد قارچی عصاره آبی گیاه آقطی ابتدا با روش انتشار از چاهک در آگار )26 )NCCLS انجام شد) 26 (. بدین منظور از سوسپانسیون هر میکروب به مقدار 1 میکرولیتر روی پلیت حاوی مولر هینتون آگار برای باکتری ها و سابورد دکستروز آگار برای قارچ ها ریخته و با سواپ استریل در سه جهت به صورت انبوه کشت داده شد. سپس در سطح هر یک از پلیت های کشت داده شده چاهک هایی به قطر تقریبا 6 میلی متر و به فاصله 2 سانتی متری از هم ایجاد گردید و درون هر چاهک مقدار 5 میکرولیتر از هر یک از رقت های آماده شده عصاره آبی با سمپلر ریخته شد. از آنتی بیوتیک های ضد باکتریایی آمپی سیلین و جنتامیسین و ضد قارچی کلوتریمازول به عنوان شاهد مثبت و از محلول DMSO به عنوان شاهد منفی استفاده گردید. پس از اتمام کار محیط های کشت باکتریایی در انکوباتور 37 درجه به مدت 24 ساعت و کشت های قارچی در انکوباتور 28 درجه به مدت 48 ساعت انکوبه گشت و در نهایت پس از گذشت 2448 ساعت کشت های میکروبی از نظر تشکیل یا عدم تشکیل هاله عدم رشد مورد بررسی قرار گرفته و قطر هاله های تشکیل شده بر حسب میلی متر اندازه گیری و گزارش شد. برای تعیین حداقل غلظت مهارکنندگی رشد) MIC ( عصاره مورد نظر از روش رقت لوله ای استفاده گردید. بدین منظور از عصاره آبی آماده شده در لوله های آزمایش حاوی میلی لیتر محیط کشت مولر هینتون براث سری رقت های 25 12/5 6/25 3/125 1/ و 2 میلی گرم بر میلی لیتر تهیه شد. سپس به هر یک از لوله ها 1 میلی لیتر از سوسپانسیون میکروبی تهیه شده تلقیح گردید. یک لوله آزمایش 29

5 حاوی محیط کشت و میکروب تلقیح شده ولی فاقد عصاره به عنوان شاهد مثبت و لوله آزمایش حاوی محیط کشت با رقت 25 میلی گرم بر میلی لیتر عصاره ولی فاقد باکتری به عنوان شاهد منفی نیز آماده گردید و در نهایت تمامی لوله های آزمایش به انکوباتور با دمای 37 درجه برای باکتری ها و دمای 28 درجه برای قارچ ها و به مدت 2448 ساعت انتقال داده شدند. بعد از انکوباسیون هر لوله از نظر کدورت حاصل از رشد میکروارگانیسم بررسی و کمترین رقتی که در آن به علت اثر مهارکنندگی عصاره کدورتی ایجاد نشده بود به عنوان MIC در نظر گرفته شد) 27 (. برای بررسی اثرات ضد باکتریایی و ضد قارچی نانوذرات نقره سنتز شده نیز از روش های انتشار چاهکی و تعیین MIC استفاده شد. سری رقت های استفاده شده برای تعیین هاله عدم رشد در روش انتشار از چاهک و 1 میکروگرم بر میلی لیتر بود و محلول 5 میکروگرم بر میلی لیتر نیترات نقره و آنتی بیوتیک ضد باکتریایی جنتامیسین و آنتی بیوتیک ضد قارچی کلوتریمازول به عنوان کنترل مثبت در نظر گرفته شد. برای تعیین MIC نیز برای هر باکتری و قارچ یک سری 1 لوله ای با رقت های /5 6/25 3/12 1/56 /78 و 4 میکروگرم بر میلی لیتر از نانوذرات نقره استفاده گردید و به عنوان کنترل مثبت از لوله حاوی فقط محیط کشت همراه با میکروب تلقیح شده به کار گرفته شد و برای کنترل منفی و به منظور اطمینان از استریل بودن مراحل انجام کار و نیز سوسپانسیون نانوذرات نقره سنتز شده درون یک لوله تنها محیط کشت و در لوله دیگری محیط کشت حاوی محلول با غلظت نیم میکروگرم بر میلی لیتر نانوذرات نقره اضافه گردید. سایر مراحل انجام کار همانند نحوه آماده سازی محیط های کشت سویه های میکروبی استفاده شده و روش انجام مشابه روش های استفاده شده در آزمایش مربوط به عصاره آبی گیاه بوده است. یافته های پژوهش بهینه سازی پارامترهای موثر بر سنتز نانوذرات: در سنتز اولیه نانوذرات نقره با استفاده از عصاره آبی برگ گیاه گیاه به عنوان عوامل احیاء کننده و پایدارکننده نقش ایفا می کند. شکل شماره 2 طیف اسپکتروفتومتری فرابنفشمرئی و تغییر رنگ محلول نانوذرات نقره بدون اعمال شرایط بهینه را نشان می دهد. با توجه به شکل شماره 2 در طول موج 45 نانومتر که مربوط به رزونانس پالسمون سطحی نانوذرات نقره می باشد عصاره فاقد پیک می باشد که این خود نشان دهنده آن است که وجود پیک در طول موج مورد نظر تنها به دلیل سنتز و وجود نانوذرات نقره می باشد و عصاره هیچ گونه تداخل احتمالی در طیف حاصل از نانوذرات نقره ایجاد نخواهد کرد. شکل شماره 2. طیف اسپکتروفتومتری فرابنفشمرئی عصاره و نانوذرات نقره سنتز شده 29

6 بررسی فعالیت ضد میکروبی نانوذرات نقره بیوسنتز شده... امید عزیزیان شرمه و همکاران در بررسی تاثیر ph پس از مخلوط کردن 2 میلی لیتر عصاره و 4 میلی لیتر از نمک نیترات نقره با غلظت 1 میلی موالر مشاهده شد که رنگ محلول به رنگ قهوه ای متمایل شده است)شکل شماره 2(. که این رنگ دلیلی بر سنتز موفق این نانوذرات می باشد. مقدار ph محلول حاصل توسط دستگاه ph متر عدد 5/28 اندازه گیری شد. به منظور مطالعه بر روی تاثیر فاکتور مهم ph بر سنتز نانوذرات ph های باالتر و کمتر از مقدار اولیه مورد بررسی قرار گرفت)شکل شماره 3(. شکل شماره 3 نشان می دهد که در ph=4 تغییری در جذب مالحظه نشده به طوری که می توان گفت سنتزی در این ph انجام نگرفته است. اما با افزایش ph محلول تا 8 جذب محلول به تدریجی میزان صورت چشمگیری افزایش یافته است که مربوط به افزایش در مقدار سنتز نانوذرات نقره است. در ph=8 طیفی متقارن با بیشترین مقدار جذب نسبت به سایر باالتر ph اما در شده است مشاهده ها ph )ph=8/5( افت شدیدی در میزان جذب مالحظه شده ph بهینه ph=8 به عنوان است. در نتیجه مقدار انتخاب شد. شکل شماره 3. طیف اسپکتروفتومتری فرابنفشمرئی نانوذرات نقره در ph های متفاوت در بررسی تاثیر میزان عصاره بر سنتز نانوذرات نقره مالحظه شد که با افزایش میزان عصاره جذب مربوط به نانوذرات نقره افزایش چشمگیری داشته است که این خود نشان دهنده افزایش در میزان سنتز نانوذرات با افزایش میزان عصاره می باشد)شکل شماره 4(. این افزایش تا 4 میلی لیتر از عصاره ادامه دارد اما در 5 میلی لیتر از آن افت شدیدی در میزان جذب مشاهده شده است. در نتیجه میزان 4 میلی لیتر از عصاره به عنوان حجم بهینه انتخاب شد. 29

7 شکل شماره 4. طیف اسپکتروفتومتری فرابنفشمرئی نانوذرات نقره در حجم های متفاوت از عصاره شکل شماره 5 تاثیر غلطت یون فلزی بر سنتز نانوذرات را نشان می دهد. با توجه به شکل شماره 5 مالحظه شد که با افزایش تدریجی در میزان غلظت یون نقره جذب مربوط به نانوذرات نقره افزایش چشمگیری داشته است. این افزایش تا غلظت 4 میلی موالر ادامه دارد اما در غلظت بیشتر از آن) 5 میلی موالر( افزایش قابل مالحظه ای در مقدار جذب مربوط به نانوذرات دیده نشد. در نتیجه مقدار غلظت 4 میلی به عنوان غلظت بهینه نیترات نقره موالر از نمک انتخاب شد. شکل شماره 5. طیف اسپکتروفتومتری فرابنشمرئی نانوذرات نقره در غلظت های متفاوت یون نقره در بررسی تاثیر دما در سنتز نانوذرات نقره مشاهده شد که با افزایش تدریجی دما میزان جذب به صورت محسوسی افزایش یافته است. اما این روند افزایش تا دمای 6 درجه سانتی گراد بوده و در دمای بعد از آن )8 درجه سانتی گراد( کاهش قابل توجهی در جذب دیده شده است)شکل شماره 6(. در نتیجه با افزایش بیش از حد دما سنتز نانوذرات کاهش خواهد یافت. لذا دمای 6 درجه سانتی گراد به عنوان دمای مطلوب انتخاب شد. 29

8 بررسی فعالیت ضد میکروبی نانوذرات نقره بیوسنتز شده... امید عزیزیان شرمه و همکاران شکل شماره 6. طیف اسپکتروفتومتری فرابنفشمرئی نانوذرات نقره در دماهای متفاوت نتایج بررسی تاثیر زمان مجاورت محلول نیترات نقره با عصاره گیاه بر روند واکنش نشان می دهند که با افزایش زمان برهمکنش میان واکنشگرها از لحظه اول مقدار جذب اندکی افزایش می یابد اما از زمان 1 دقیقه به بعد تغییر محسوسی در مقدار این جذب مشاهده نشده است که این مشاهده پایدار بودن نانوذرات حاصل را ثابت می کند. در نتیجه زمان 1 دقیقه به عنوان زمان بهینه انتخاب شد)شکل شماره 7(. شکل شماره 7. طیف اسپکتروفتومتری فرابنفشمرئی نانوذرات نقره در زمان های متفاوت بررسی تصویر میکروسکوپ الکترونی عبوری توزیع شکل و اندازه نانوذرات نقره سنتز شده توسط تصویر میکروسکوپ الکترونی عبوری بررسی شد. شکل شماره 8 تصویر میکروسکوپ الکترونی :)TEM( عبوری نانوذرات نقره سنتز شده با اعمال تمامی شرایط بهینه شده را نشان می دهد. تصویر نشان می دهد که نانوذرات به دست آمده همگی تقریبا کروی بوده و اندازه متوسط آن ها بین 812 نانومتر بوده است. 22

9 شکل شماره 8. تصویر میکروسکوپ الکترونی عبوری نانوذرات نقره سنتز شده بررسی طیف پراش پرتو ایکس) XRD (: برای بررسی بیشتر و مطالعه ساختار بلوری نانوذرات نقره سنتز شده از آنالیز پراش پرتو ایکس استفاده شد )شکل شماره (. میانگین اندازه دانه های بلوری با محاسبه پهنای پیک های تشکیل شده در نمونه ها با استفاده از فرمول دبایشرر)فرمول 1( برآورد شد: فرمول 1 : که β پهنای پیک ها در نصف ارتفاع ماکزیمم λ طول موج اشعه X برابر با 1/54 نانومتر θ زاویه بین پرتو باز تابش و تابش و D اندازه دانه های بلوری می باشد. در نواحی 38/17 و 77/55=2θ 64/56 44/37 نانوذرات طال پیک های شارپ و تیزی را نشان می دهند که دلیلی بر سنتز موفق نانوذرات می باشد. آنالیز ساختاری نشان می دهد که نانوذرات نقره دارای ساختار بلوری با شاخص های میلر) 111 ( )2( )22( )311( و در شبکه مکعبی می باشد. وجود قله های تیز در الگوها نشان دهنده درجه باالیی از بلورینگی برای نانوذرات می باشد. پیک) 111 ( از سایر پیک ها شدیدتر است در نتیجه صفحات بلوری نانوذرات نقره بیشتر در این جهت تشکیل شده اند. میانگین اندازه دانه های بلوری سنتز شده با محاسبه فرمول دبایشرر 11/658/87 نانومتر برآورد شدند که با نتایج حاصل از میکروسکوپ الکترونی عبوری و نتایج به دست آمده از بررسی طیف اسپکتروفتومتری فرابنفشمرئی کامال مطابقت دارد. شکل شماره 9. تصویر پراش پرتو ایکس نانوذرات نقره سنتز شده 11

10 بررسی فعالیت ضد میکروبی نانوذرات نقره بیوسنتز شده... امید عزیزیان شرمه و همکاران بررسی فعالیت ضد میکروبی عصاره گیاه: نتایج بررسی اثرات ضد باکتریایی و ضد قارچی عصاره آبی گیاه آقطی نشان داد عصاره اثر مهارکنندگی قابل توجه ای بر روی همه باکتری ها و قارچ ها دارد که با افزایش غلظت عصاره این اثر بازدارندگی و قطر هاله عدم رشد نیز بیشتر می شود. نتایج حاصل از تاثیر غلظت های مختلف عصاره آبی گیاه آقطی با روش انتشار چاهکی در جدول شماره 1 نشان داده شده که حساسیت بیشتر باکتری های گرم مثبت نسبت به باکتری های گرم منفی و نیز قارچ ها مشخص است. جدول شماره 2 نتایج مربوط به حداقل غلظت مهارکنندگی رشد) MIC ( عصاره آبی گیاه آقطی علیه میکروب های منتخب به روش رقت لوله ای را نشان می دهد. بیشترین حساسیت را در بین باکتری های مورد آزمایش باکتری استافیلوکوکوس اورئوس) 12/5 )MIC و در بین قارچ ها کاندیدا آلبیکنس) 6/25 )MIC و کمترین حساسیت به عصاره را باکتری سودوموناس آئروژینوزا) 1 )MIC دارند. جدول شماره 1. قطر هاله عدم رشد میکروبی در غلظت های مختلف عصاره آبی گیاه آقطی میکروارگانیسم استافیلوکوکوس اورئوس باسیلوس سرئوس اشرشیا کلی سودوموناس آئروژینوزا آسپرژیلوس نایجر کاندیدا آلبیکنس با روش انتشار از چاهک)بر حسب میلی متر( غلظت های مختلف عصاره آبی )میلی گرم بر میلی لیتر( آمپی سیلین جنتامیسین کلوتریمازول DMSO جدول شماره 2. حداقل غلظت مهار کننده رشد میکروب) MIC ( در غلظت های مختلف میکروارگانیسم ها استافیلوکوکوس اورئوس باسیلوس سرئوس اشرشیا کلی سودوموناس آئروژینوزا آسپرژیلوس نایجر کاندیدا آلبیکنس عصاره آبی گیاه آقطی)بر حسب میلی گرم/میلی لیتر( 1/56 بررسی فعالیت ضد میکروبی نانوذرات نقره سنتز شده توسط عصاره گیاه آقطی: نتایج تست های ضد میکروبی مربوط به نانوذرات نقره سنتز شده با روش های انتشار چاهکی و تعیین MIC به ترتیب در جدول شماره 3 و 4 ارائه شده است. نانوذرات سنتز شده اثر میکروب کشی چشمگیری بر روی نمونه های مورد آزمایش نشان دادند به طوری که در غلظت های بسیار پایین از رشد باکتری ها و قارچ ها جلوگیری کردند و این در حالی است که عصاره آبی گیاه در غلظت های استفاده شده مربوط به نانوذرات فاقد هر گونه اثر ضد غلظت های مختلف عصاره آبی )میلی گرم بر میلی لیتر( /5 6/25 3/12 2 میکروبی بوده و هم چنین اثر ضد میکروبی نقره نیز در مقایسه با نانوذرات نقره بسیار کمتر می باشد. نتایج نشان می دهد که نانوذرات نقره بیشترین تاثیر را روی باکتری اشرشیا کلی)قطر هاله 22 میلی متر و )MIC 3/12µg/ml و قارچ آسپرژیلوس نایجر)قطر هاله 21 میلی متر و )MIC 3/12 µg/ml داشته و کمترین تاثیر را روی باکتری استافیلوکوکوس اورئوس )قطر هاله 17 میلی متر و و )MIC 25 µg/ml داشته است. 1

11 جدول شماره 3. قطر هاله عدم رشد میکروبی در غلظت های مختلف نانوذرات نقره با روش انتشار از چاهک)بر حسب میلی متر( میکروارگانیسم استافیلوکوکوس اورئوس باسیلوس سرئوس اشرشیا کلی سودوموناس آئروژینوزا آسپرژیلوس نایجر کاندیدا آلبیکنس میکرو ارگانیسم ها استافیلوکوکوس اورئوس باسیلوس سرئوس اشرشیا کلی سودوموناس آئروژینوزا آسپرژیلوس نایجر کاندیدا آلبیکنس بحث و نتیجه گیری غلظت های مختلف نانوذرات نقره )میکروگرم بر میلی لیتر( 1 محلول نمک نقره )5 µg/ml( کلوتریمازول )5 µg/ml( جنتامیسین )5 µg/ml( جدول شماره 4. حداقل غلظت مهار کننده رشد میکروب) MIC ( در غلظت های مختلف نانوذرات نقره)بر حسب میکروگرم/میلی لیتر( 1/56 /78 غلظت های مختلف نانوذرات نقره )میکروگرم بر میلی لیتر( /5 6/25 3/ نانوذرات از آن جا که پلی بین حالت حجیم ماده و حالت اتمی یا مولکولی هستند مورد توجه قرار گرفته اند) 28 (. نانوذرات فلزی به خاطر خصوصیات جالب توجه الکتریکی اپتیکی شیمیایی و مغناطیسی که از خود نشان داده اند مورد بررسی های فراوان قرار گرفته اند) 2 (. گیاه آقطی یکی از گیاهان دارویی خودرو و بومی در شمال ایران می باشد که به وفور در استان های گلستان مازندران و گیالن یافت می شود. در بیوسنتز نانوذرات فلزی بر پایه احیای زیستی عصاره گیاه به عنوان احیاء کننده و پایدارکننده استفاده می شود. پژوهش های متعددی فعالیت آنتی اکسیدانی باالی برگ این گیاه را گزارش کرده اند) 3 (. بنا بر این بررسی پتانسیل عصاره برگ آقطی می تواند راهکاری برای استفاده موثر از آن و روشی ارزان و زیست سازگار برای تولید نانوذرات باشد. بررسی انجام شده در این تحقیق نشان داد که عصاره برگ آقطی پتانسیل باالیی برای تولید نانوذرات نقره دارد. تولید نانوذرات به این روش به صورت یک مرحله ای و مقرون به صرفه بوده در زمان بسیار کم فرآیند تکمیل می شود. تغییر در رنگ محلول از شفاف به قهوه ای و هم چنین افزایش میزان جذب محلول به دلیل احیاء یون نقره و تجمع آن ها به صورت نانوذرات نقره می باشد. در بررسی های فاکتورهای موثر بر سنتز نانوذرات نقره ph یکی از مهم ترین فاکتورهای موثر بر سنتز نانوذرات نقره می باشد) 31 (. پیش از این گزارش هایی مبنی بر تاثیر ph بر روی چگونگی تشکیل نانوذرات به ثبت رسیده است. گزارش ها حاکی از آن است که ph بر روی شکل نانوذرات تاثیر چشمگیری نداشته و تنها اندازه آن ها را به میزان زیاد تحت تاثیر قرار می دهد) (. در بررسی این عامل گزارشات نشان می دهد که در ph های خیلی باال یون های نقره هیدرولیز شده به گونه ای که موجب به وجود آمدن گونه های پایدار هیدروکسیدهای یون نقره می شود و در انتها از ورود این یون ها به واکنش احیای زیستی ممانعت می شود) 34 (. پهن شدن طیف های جذبی در ph های بیشتر بدین علت است که در اسیدیته های باالتر نانوذراتی با اندازه بزرگ تر)به علت اتصال ذرات 19

12 بررسی فعالیت ضد میکروبی نانوذرات نقره بیوسنتز شده... امید عزیزیان شرمه و همکاران ریز تر به هم( به وجود خواهد آمد که این اتفاق موجب پهن شدن تقریبی طیف ها می شود. پهن شدن طیف ها در اثر افزایش اندازه نانوذرات پیش از این گزارش شده است) 35 (. بدین دلیل اسیدیته 8 به عنوان بهینه ph انتخاب شد. همان طوری که قبال اشاره شد در سنتز زیستی نانوذرات توسط گیاهان گیاه نقش احیاء کردن یون های فلزی و هم چنین تثبیت کردن این نانوذرات را ایفا می کند) 36 (. گیاه آقطی نیز دارای ترکیبات طبیعی فراوانی چون ترکیبات آنتی اکسیدانی فنل ها فالونوئیدها و... می باشد) 37 ( که تمامی این ترکیبات در احیای یون های فلزی و تبدیل آن ها به اتم های فلزی در ابعاد نانومتریک و پایدار کردن نانوذرات سنتز شده نقش مهمی دارند. مطالعات نشان می دهند که در غلظت های کمتر از میزان بهینه عامل احیاء کننده و پایدار کننده عمل احیاء کنندگی و پایدارسازی نانوذرات به صورت کامل اتفاق نیافتاده و نانوذرات به میزان کمتر و با اندازه درشت تری به دست می آید. هم چنین با افزودن مقدار بیشتر از میزان بهینه ذرات پایدارکننده به دور خود بیشتر تجمع کرده که این عمل موجب می گردد پایدارسازی به طور کامل انجام نشده و ذرات با اندازه درشت تری به دست آید. با بی ثبات شدن نانوذرات از جمعیت نانوذرات پایدار در محیط کم شده و جذب کاهش خواهد یافت. پژوهش ها حاکی از آن است که با افزایش در اندازه نانوذرات میزان جذب کاهش یافته و متقابال با افزایش در توزیع ذرات پهنای طیف ها افزایش می یابد) 38 3 (. در نتیجه میزان 4 میلی لیتر از عصاره به عنوان حجم مناسب برای احیای یون های نقره انتخاب شد. پژوهش های متعددی تاثیر غلظت یون فلزی بر سنتز نانوذرات را اثبات کرده اند. مطالعات نشان می دهد با افزایش غلظت یون فلز جذب مشاهده شده نیز افزایش می یابد که این پدیده بدین علت است که با افزایش مقدار یون فلز یون های بیشتری احیاء شده و نتیجتا نانوذرات بیشتری تولید خواهد شد) 4 (. اما کاهش بیش از حد یا افزایش نامحسوس در مقدار جذب مربوط به نانوذرات در اثر افزایش بیش از اندازه غلظت یون نقره می تواند به دلیل چسبندگی نانوذرات و سنتز نانوذراتی با اندازه بزرگ تر باشد) 41 (. با توجه به دالیل ذکر شده غلطت 4 میلی موالری از یون نقره به عنوان غلظت مناسب انتخاب شد. هم چنین مطالعات حاکی از آن است که دما تاثیر به سزایی بر میزان جذب و اندازه نانوذرات سنتز شده دارد. مشاهدات نشان می دهد که با افزایش دمای محیط واکنش مقدار جذب خوانده شده افزایش یافته اما اندازه نانوذرات کاهش خواهد یافت) 42 (. افزایش دما احتمال و سرعت برخورد مولکول های احیاء کننده و تثبیت کننده با یون های فلزی را افزایش می دهد به صورتی که بالفاصله پس از عمل احیاء و تثبیت فرصتی برای اتصال نانوذرات سنتز شده به یکدیگر و تولید نانوذرات با اندازه درشت تر وجود نخواهد داشت) 43 (. اما کاهش در میزان جذب به دلیل افزایش بیش از حد دما می تواند به دلیل تجزیه و یا از بین رفتن تمامی و یا بخشی از ترکیبات احیاء کننده و پایدارکننده در عصاره گیاه باشد. مطالعات پیشین تخریب ترکیبات موجود در گیاه در اثر افزایش بیش از حد دما را به اثبات رسانیده اند) 44 (. در نتیجه مناسب ترین شکل و اندازه نانوذرات نقره در این روش در دمای 6 درجه سانتی گراد به دست خواهد آمد. زمان نیز همانند فاکتورهای مورد بحث تاثیر به سزایی در سنتز و پایدار بودن نانوذرات دارد) 45 ( به طوری که در واکنش های این چنینی اگر سنتز کامل انجام نشده باشد با گذشت زمان تولید نانوذرات بیشتر خواهد بود. هم چنین عامل زمان مهم ترین فاکتور برای اثبات پایداری نانوذرات سنتز شده می باشد. به گونه ای که اگر با گذشت زمان افزایش قابل توجه ای در میزان جذب نانوذرات نقره مالحظه نشود می توان این گونه استنباط کرد که نانوذرات حاصل با گذر زمان کامال پایدار هستند. با توجه به دالیل عنوان شده واکنش احیای یون های نقره توسط عصاره آبی برگ آقطی در 1 دقیقه کامل شده است. در سالیان اخیر مقاومت گسترده باکتری ها به آنتی بیوتیک ها سبب شد تا محققین به دنبال راهکاری مناسب برای کشف مواد جایگزین آنتی بیوتیک ها باشند. در سال 16 از نیترات نقره 5 درصد برای درمان سوختگی ها استفاده می شد) 46 ( و با پیشرفت علم در حوضه نانوتکنولوژی در سال 24 با بررسی اثرات نانوذرات نقره بر روی باکتری E.coli این 19

13 نانوذرات را به عنوان عامل ضد میکروبی جدید معرفی کردند) 47 (. نانوذرات دارای نسبت سطح به حجم بسیار زیادی هستند و در مورد نقره به طور خاص این افزایش سطح باعث شده که یک گرم نانوذرات نقره برای کشتن باکتری های صد متر مربع از یک سطح کافی باشد. ویژگی نانوذرات نقره از لحاظ شکل و اندازه باعث شده که این نانوذرات بتوانند با تخریب غشاء فعالیت ضد میکروبی باالیی از خود نشان دهند) 48 ( و مجموعه این خصوصیات باعث کاربرد فراوان نانوذرات نقره در پزشکی و بهداشت مانند ضد عفونی کردن آب های آشامیدنی استفاده در فیلترهای کربنی و از بین بردن میکروب های هوا شده است. هم چنین این نانوذرات امروزه به عنوان پوشش های ضد میکروب در تجهیزات پزشکی و نیز تولید ژل های ضد میکروب در درمان سوختگی ها استفاده می شوند) 4 5 (. در این پژوهش فعالیت ضد میکروبی عصاره آبی گیاه آقطی و نیز نانوذرات نقره تهیه شده توسط عصاره این گیاه بر روی 4 باکتری و 2 قارچ صورت گرفت و مشخص شد که نانوذرات در غلظت های مربوطه اثرات ضد میکروبی بسیار قوی تری نسبت به خود عصاره و محلول نقره دارا می باشند. البته میزان فعالیت ضد میکروبی هم در عصاره و هم در محلول های نانوذرات وابسته به غلظت بود. الگوهای مقاومت باکتری ها در برابر عصاره حساسیت بیشتر باکتری های گرم مثبت را نسبت به گرم منفی ها نشان دادند به طوری که در غلظت های پایین 25 mg/ml باکتری های گرم منفی برخالف گرم مثبت رشد کرده و مقاوم بودند. البته با افزایش غلظت)باالی 5( mg/ml رشد هر دو گروه مهار شد. هم چنین بررسی اثرات ضد قارچی عصاره حساسیت نسبتا باالی این گروه را به عصاره نشان داد. در بررسی اثرات ضد میکروبی نانوذرات نقره تاثیر چشمگیر این نانوذرات بر علیه همه میکروب های مورد آزمایش نشان داده شد که در این بین و بر خالف عصاره نانوذرات اثر مهارکننده قابل مالحظه ای روی باکتری های گرم منفی نسبت به گرم مثبت ها داشتند. خاصیت ضد میکروبی عصاره گیاه آقطی و نانوذرات نقره در مطالعات زیادی بر علیه انواع مختلفی از میکروب های بیماریزای انسانی بررسی و به اثبات رسیده است. رودینو و همکاران در سال 215 بیشترین فعالیت ضد میکروبی عصاره آقطی را بر روی P. fluorescens و E. fecalis اعالم کردند) 51 (. ساندی و همکاران در سال 24 فعالیت ضد میکروبی نانوذرات نقره را روی E.coli وابسته به غلظت نانوذرات اعالم کردند) 52 (. در مطالعه دیگری کیم و همکاران در سال 27 نشان دادند که اثرات نانوذرات نقره بر روی E.coli بیشتر از S.aureus می باشد) 53 (. در گزارشی دیگر شریواستاوا و همکاران در سال 27 و گوزمان و همکاران در سال 212 با بررسی فعالیت ضد میکروبی نانوذرات نقره روی باکتری های مختلف مانند P.aeroginosa E.coli و S.aureus اعالم داشته اند که هر چند فعالیت نانوذرات وابسته به غلظت است ولی برای باکتری های گرم منفی به نسبت گرم مثبت این اثر چشمگیرتر بوده است) 5456 (. در واقع تفاوت پاسخ باکتری های گرم مثبت و گرم منفی به نانوذرات نقره به تفاوت موجود در ساختار دیواره سلولی آن ها مربوط می باشد به طوری که باکتری های گرم منفی دیواره سلولی نازک تر و با استحکام کمتر داشته و نیز وجود الیه ای از لیپوپلی ساکارید در سطح بیرونی شان که سرشار از بارهای منفی است برهمکنش بین نانوذرات نقره که دارای بار مثبت ضعیف می باشند را با این سلول های باکتریایی تسهیل می کند. اتصال نانوذرات به سطح سلول ابتدا دیواره را سوراخ و سپس با ورود نانوذره به داخل سلول باکتری و ایجاد تداخل در مسیرهای مختلف متابولیکی و تولیدمثل در نهایت منجر به مرگ باکتری می شود) 57 (. به طور کلی نتایج این پژوهش پتانسیل باالی عصاره آبی برگ گیاه آقطی را در احیای یون های فلزی و تبدیل آن ها به اتم های فلزی در ابعاد نانومتریک را نشان می دهد. وجود فعالیت ضد میکروبی باالی عصاره و نانوذرات نقره سنتز شده از آن استفاده از آن ها را در زمینه های مختلف به منظور پیشگیری از آلودگی و انتشار عوامل بیماری زایی پیشنهاد می کند. سپاسگزاری بدین وسیله از حمایت های مالی دانشگاه سیستان و بلوچستان تقدیر و تشکر می شود. 19

14 بررسی فعالیت ضد میکروبی نانوذرات نقره بیوسنتز شده... امید عزیزیان شرمه و همکاران References 1.Panacek A, Kvitek L, Prucek R, Kolar M, Vecerova R, Pizurova N, et al. Silver colloid nanoparticles synthesis characterization and their antibacterial activity. J Phys Chem B 26; 11: Govindaraju K, Tamilselvan S, Kiruthiga V, Singaravelu G. Biogenic silver nanoparticles by Solanum torvum and their promising antimicrobial activity. J Biopest 21; 3: Nanda A, Saravanam M, Hil MP. Biosynthesis of Silver Nanoparticles from Staphylococcus aurous and its antimicrobial activity against MRSA and MRSE. Nanomedicine 29; 5: Gajbhiye M, Kesharwani J, Ingle A, Gade A, Rai M. Fungus mediated synthesis of silver nanoparticles and their activeity against pathogenic fungi in combination with fluconazole. Nanomed 29; 5: Shahverdi AR, Minaeian S, Shahverdi HR, Jamalifar H, Nohi AA. Rapid synthesis of Silver Nanoparticles using culture supernatants of enter bacteria a novel biological approach. Proc Biochem 27; 42: Shankar SS, Rai A, Ahmad A, Sastry M. Rapid synthesis of Au Ag and bimetallic Au core Ag shell Nanoparticles using Neem leaf broth. J Coll Interface Sci 22; 275: Mohasseli T, Pourseyyedi Sh. [Green synthesis and characterization of Silver Nanoparticles using seed aqueous extract of Sesame]. Biotechnol Tarbiat Modares Uni 215; 1:12. (Persian) 8.Ahmad N, Sharma S, Alam MK, Singh VN, Shamsi SF, Mehta BR, et al. Rapid synthesis of Silver Nanoparticles using dried medicinal plant of basil. Coll Surf Bio Interfaces 21; 81: Wang Y, He X, Wang K, Zhang X, Tan W. Barbate Skull cup herb extract mediated biosynthesis of gold nanoparticles and its primary application in electrochemistry. Coll Surf Bio Interfaces 29; 73: Ashiri S, Safari J. [Synthesis of gold and Silver Nanoparticles in plant substrates and their application]. Nanotechnology 213; 186:1215. (Persian) 11. Zhanjiang Z, Jinpei L. Synthesis and characterization of Silver Nanoparticles by a Sonochemical method. Rare Metal Mate Eng 212; 1: Jianrong C, Yuqing M, Nongyue H, Xiaohua W, Sijiao L. Nanotechnology and biosensors. Biotech Adv 24; 22: Kaviya S, Santhanalakshmi J, Viswanathan B, Muthumary J, Srinivasan K. Biosynthesis of silver nanoparticles using citrus sinensis peel extract and its antibacterial activity. Spectrochim Acta Mol Biomol Spe 211; 79: Chaloupka K, Malam Y, Seifalian AM. Nanosilver as a new generation of Nanoproduct in biomedical applications. Trends Biotechnol 21; 28: Cho KH, Park JE, Osaka T, Park S. The study of antimicrobial activity and preservative effects of nanosilver ingredient. Electrochim Acta 25; 51: Cao YWC, Jin RC, Mirkin CA. Nanoparticles with Raman spectroscopic fingerprints for DNA and RNA detection. Science 22; 297: Christian P, Vonderkammer F, Baalousha M, Hofmann T. Nanoparticles structure properties preparation and behavior in environmental media. Ecotoxicology 28; 5: Marambiojones C, Hoek EMV. A review of the antibacterial effects of Silver Nanomaterials and potential implications for human health and the environment. J Nanoparticle Res 21; 5: Gardeatorresdey JL, Parsons JG, Dokken K, Peraltavidea J, Troiani, HE, Santiago P, et al. Alfalfa sprouts a natural source for the synthesis of silver nanoparticles. Langmuir 23; 19: Dwivedi AG, Gopol K. Biosynthesis of silver and gold nanoparticles using Chenopodium album leaf extracts. Coll Suf Phys Eng Asp21; 36: Kamal SSK, Prasanta HRS, Johnson V, Manda P, Shankar R, Loganathan D. A novel green chemical route for synthesis of Silver Nanoparticles using Camellia sinensis. Acta Chim Slov 21; 57: Ghorbani P, Hamidialamdari D, Namvar F, Yaghmaei P. [Investigating the antioxidant properties of Silver Nanoparticle synthesized by green method]. J Ilam Uni Med Sci 216; 7:1819. (Persian) 19

15 23.Iravani S, Zolfaghari B. Green synthesis of Silver Nanoparticles using Pinus eldarica barks extract. Biomed Res Int 213; 78: Vonwhite G, Kerscher P, Brown RD, Morella J, Mcallister W, Dean D, et al. Green synthesis of robust biocompatible Silver Nanoparticles using Garlic extract. J Nanomate 212; 26: Chahardooli M, Khodadadi E. [The biosynthesis of Silver Nanoparticles using Oak fruit extract and investigating their antimicrobial activities against nosocomial infection agents]. J Ilam Uni Med Sci 214; 22: (Persian) 26.Clinical and Laboratory Standards Institute. Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically approved standard. 17 th.ed.22; P Riesenberg A, Kaspar H, Febler AT, Werckenthin C, Schwarz S. Susceptibility testing of Rhodococcus equi an interlaboratory test. Vet Microbiol 216;194:35 28.Kaushikthakkar N, Snehitmhatre S, Raseshparikh Y.Biological synthesis of Metallic Nanoparticles. Nanomedicine 21; 28: Azizinshermeh O, Valizadeh J, Noroozifar M, Ghasemi A, Valizadeh M. [Optimization, characterization and antimicrobial activity of gold nanoparticles biosynthesized using aqueous extract of Sambucus ebulus. L]. Phytochem J Med Plants 216; 1:118. (Persian) 3.Ebrahimzadeh MA, Pourmorad F, Bekhradnia AR. Iron chelating activity phenol and flavonoid content of some medicinal plants from Iran. African J Biol Technol 28; 18: Waghmar SS, Deshmukh AM, Sadowski Z. Biosynthesis, optimization, purification and characterization of gold nanoparticles. African J Microbiol Res 214;2: GardeaTorresdey JL, Tiemann KJ, Gamez G, Dokken K, Tehuacanero S, Jose Yacaman M. Gold Nanoparticles Obtained by BioPrecipitation from Gold (III) Solutions. J Nanopart Res 1999; 1: Armendariz V, Herrera I, Peraltavidea JR, Joseyacaman M. Size controlled gold nanoparticle formation by avena sativa biomass use of plants in nanobiotechnology. J Nanopart Res24; 6: Supraja S, Chakravarthy N, Sagadevan K. Green Synthesis of Silver Nanoparticles from Cynodon dactylon leaf extract. J Chem Technol Res 213; 1: Shenya DS, Mathewa J, Philip D. Phytosynthesis of Au Ag and AuAg bimetallic nanoparticles using aqueous extract and dried leaf of Anacardium occidentale. Acta Mole Biomole Spect 211; 79: Philip D. Green synthesis of gold and silver nanoparticles using Hibiscus rosasinensis. Physica E 21; 42: Shokrzadeh M, Saeedisaravi SS. The chemistry pharmacology and clinical properties of Sambucus ebulus a review. J Med Plants Res21; 4: Dubeya SHP, Lahtinen M, Sillanpaaa M. Tansy fruit mediated greener synthesis of silver and gold Nanoparticles. Proce Biochem21; 45: Foroghirad S, Khatibzadeh M. [Green synthesis of silver nanoparticles used in conductive inks using sonochemical method]. Iranian J Chem Eng 215; 34:19. (Persian) 4.Dwivedi AG, Gopol K. Biosynthesis of silver and gold nanoparticles using Chenopodium album leaf extracts. Coll Suf Phys Eng Asp 21; 36: Mock JJ, Barbic M, Smith DR, Schultz DA, Schultz S. Shape effects in Plasmon resonance of individual colloidal silver nanoparticles. J Chem Phys 22; 116: Rai A, Singh A, Ahmad A, Sastry M. Role of halide ions and temperature on the morphology of biologically synthesized gold Nano triangles. Langmuir 26; 2: Kaviya S, Santhanalakshmi J, Viswanathan B. Green Synthesis of Silver Nanoparticles Using Polyalthia longifolia Leaf extract along with DSorbitol study of antibacterial activity. J Nanotechnol 21; 211: Basiri SH. [Investigation of the effect of temperature and air velocity in the dryer on the amount and quality of essential oil of Thymus]. Inn Sci Food Technol J 211; 4:7382. (Persian) 45.Praveen Kumar k, Paul W, Chandra P SH. Green synthesis of gold nanoparticles with Zingiber officinale extracts

16 بررسی فعالیت ضد میکروبی نانوذرات نقره بیوسنتز شده... امید عزیزیان شرمه و همکاران characterization and blood compatibility. Proce Biochem 211; 46: Moyer CA, Brentano L, Gravens DL, Margraf HW, Monafo WW. Treatment of large human burns with.5% silver nitrate solution. Arch Surg 1965; 9: Sondi I, SalopekSondi B. Silver nanoparticles as antimicrobial agent: a case study on E. coli as a model for gram negative bacteria. J Colloid Interface Sci 24; 275: Morones JR, Elechiguerra JL, Camacho A, Holt K, Kouri JB, Ramírez JT, et al.the bactericidal effect of silver nanoparticles. Nanotechnology 25; 16: Kenneth K, Wong Y, Liu X. Silver nanoparticles the real silver bullet in clinical medicine. Med Chem Commun 21; 1: Tran QH, Nguyen VQ, Le AT. Silver nanoparticles: synthesis properties, toxicology, applications and perspectives. Adv Nat Sci 213; 4: Rodinol S, Butu A, Petrache P, Butu M, Dinupirvu C, Cornea CA. Evaluation of the antimicrobial and antioxidant activity of Sambucus ebulus extract. Farmacia 215; 5: Sondi I, Salopeksondi B. Silver nanoparticles as antimicrobial agent: a case study on E. coli as a model for Gramnegative bacteria. J Colloid Interface Sci 24; 275: Kim JS, Kuk E, Yu KN, Kim JH, Park JP, Lee HJ, et al. Antimicrobial effects of silver nanoparticles. Nanomed Nanotechnol 27; 3: Shrivastava S, Bera T, Roy A, Singh G, Ramachandrarao P, Dash D. Characterization of enhanced antibacterial effects of novel silver nanoparticles. Nanotechnology 27; 18: Guzman M, Dille J, Godet S. Synthesis and antibacterial activity of silver nanoparticles against grampositive and gramnegative bacteria. Nanomedicine 212; 8: Nabipour Y, Rostamzad A, Ahmadyasbchin S. [The Evaluation of Antimicrobial Properties of Zinc and Silver Nanoparticles on Pathogenic Bacteria Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus]. J Ilam Uni Med Sci 215; 5: (Persian) 57.Moadi T, Ghahramanzadeh R, Yosofi M, Mohammadi, F. [Synthesis of silver nanoparticles using four species plant and investigation of their antimicrobial activity]. Iranian J Chem Eng214, 4: 19. (Persian) 19

17 Abstract Investigating the Antimicrobial Activities of Silver Nanoparticles Biosynthesized by Aqueous Extract of Sambucus ebulus L. Azizianshermeh O 1 *, Valizadeh J 2, Noroozifar M 1, Qasemi A 2 (Received: April 24, 216 Accepted: May 9, 216) Introduction: The use of antimicrobial compounds in plants and nanoparticles for control and treatment of disease agents have been extensively studied. The present study aimed to biosynthesis of silver nanoparticles using leaf aqueous extract of Sambucus ebulus L. and study of their antimicrobial activity. Materials & methods: To biosynthesis of silver nanoparticles, fresh extract was prepared and added to silver nitrate solution with concentration 1 mm. Effective parameters on synthesis of silver nanoparticles such as; ph, the volume of extract, silver ion concentration, temperature and reaction time were optimized and studied to obtain individual shape and size of nanoparticles. Antimicrobial activities of extract and silver nanoparticles were studied with the Disc diffusion and MIC methods against four bacterias such as; Staphylococcus aureus (PTTC 1112), Bacillus cereus (PTTC 1154), Escherichia coli (PTTC 1399), Pseudomonas aeruginosa (PTTC 177) and two Fungus such as; Aspergillus niger (PTTC 512) and Candida albicans (PTTC 527). 1.Dept of Chemistry, Faculty of Science, Sistan and Baluchestan University, Zahedan,Iran 2.Dept of Biology, Faculty of Science, Sistan and Baluchestan University, Zahedan, Iran Corresponding author omidaziziyan@yahoo.com Findings: After adding the extract to the silver nitrate solution, the color changed to brown that represents to successful synthesis of silver nanoparticles. Silver nanoparticles showed maximum absorbance at 45 nm and they were spherical shape and the average size of them had been between 812 nm. These nanoparticles showed significant antimicrobial activity on samples, so that they were prevented the growth of bacterias and fungus in very low concentration. Discussion & conclusions: Because of existing the antioxidant properties and many secondary compounds in plant, they have a role in reducing and stabilizing the nanoparticles. In this study, the silver nanoparticles synthesized by leaf aqueous extracts of S. ebulus. The silver nanoparticles showed high antimicrobial activity. Keywords: Antimicrobial activity, Silver nanoparticles, Sambucus ebulus L, Biosynthesis Scientific Journal of Ilam University of Medical Sciences 19